单位：李子俊 陈颜芳 彭仲生 林秋雄 聂玉强 王启仪(广东省人民医院消化内科，广东广州510080)
关键词：胃炎；螺杆菌；幽门；细胞凋亡；增殖细胞核抗原；凋亡基因；
癌症000111
摘 要：目的：探讨幽门螺杆菌HP引起胃粘膜上皮细胞凋亡和增殖改变及HP致癌作用的可能机制。方法：采用免疫组织化学方法及脱氧核糖核酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)技术，对HP阳性和HP阴性者胃粘膜上皮中增殖细胞，凋亡细胞进行原位观察和比较，同时检测bc1-2/bax蛋白表达状态。结果：HP阳性者胃粘膜上皮细胞增殖指数和凋亡指数显著高于HP阴性者(P<0.01)。bax蛋白表达阳性率在HP阳性组较HP阴性组升高显著(P<0.01)，而bcl-2蛋白表达阳性率两组差异不显著(P>0.05)。在HP阳性慢性胃炎中，bcl-2蛋白表达阳性组细胞凋亡指数显著低于阴性组(P<0.01)。bax蛋白表达阳性组细胞凋亡指数显著高于阴性组(P<0.01)。结论：HP可诱导胃粘膜上皮细胞凋亡和过度增殖，bcl-2蛋白低表达和bax蛋白高表达参与此调节机制，推测认为HP在胃癌的发生过程中可能有重要意义。
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分类号：R573.3；R735.2 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)01-0040-02
Apoptosis and the expression of bcl-2 and bax
in Helicobacter pylori related gastritis
LI Zi-jun, CHEN Yan-fan, PENG Zhong-sheng, et al.
(Department of Gastroenterology, Guangdong Provincial People s Hospital,Guangzhou 510080,P.R.China )
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Abstract：Objective：To investigate the bc1-2 and bax protein expression and its association with apoptosis and cell proliferation in Helicobacter pylori (HP) related gastritis. Methods：Using immunohistochemical staining and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labelling (TUNEL) technique, we observed bcl-2 and bax protein expression and the change of gastric epithelial apoptotic index (AI) and proliferative index (PI) in HP-related gastritis (n=43). Results：AI and PI in HP positive gastritis were significantly higher than that in HP negative gastritis (P<0.01).The positive rate of bax protein expression in HP positive gastritis was significantly higher than that in HP negative gastritis (P< 0.01), whereas the positive rate of bc1-2 protein expression was similar in both groups (P>0.05). In HP positive gasitritis,the percentage of apoptotic cells in the bcl-2 negative group was higher than that in the bc1-2 positive group, the percentage of apoptotic cells in the bax negative group was lower than that in the bax positive group (P<0.01). Conclusions：HP may be involved in the induction of the apoptosis and proliferation of gastric epithelial cells. The bcl-2 may inhibit apoptosis and the bax may promote apoptosis in HP positive gastritis.
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Key words：Gastritis; Helicobacter pylori; Apoptosis; Cell proliferation; Gene expression ▲
众多研究显示幽门螺杆菌(HP)是慢性胃炎、消化性溃疡的主要原因，同时与胃癌发生关系密切。国际癌症研究中心(LARC)已将幽门螺杆菌感染列为第一类致癌因子[1]。但究其致癌机制尚不清楚。细胞凋亡是在基因调控下的主动性细胞死亡过程，是程序性细胞死亡的主要形式，该过程的异常与肿瘤的发生及其生物学特性有密切关系[2]。本研究从HP感染的早期胃粘膜病变状态着手，检测胃粘膜组织细胞凋亡、增殖及bcl-2/bax基因表达改变，旨在探讨HP感染引起胃粘膜细胞动力学改变的机制和意义。
1材料和方法
1.1材料
, 百拇医药 标本取自经胃镜及病理证实为慢性活动性胃炎的患者，共43例，其中HP阳性23例，HP阴性20例。将活检采取的胃粘膜标本行组织病理切片。HP检测采用快速尿素酶试验和病理Warthin-starry(WS)银染色，两项阳性为阳性，两项阴性为阴性。
1.2细胞凋亡检测
采用末端转移酶介导的dUTP切口末端标记方法(TUNEL)检测凋亡细胞。简要步骤为石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，蛋白酶K(20mmol/L)处理，Tunel反应液37℃下作用1小时，中止和冲洗后用抗地戈辛复合物作用30分钟，DAB显色，甲基绿复染。细胞核为棕褐色颗粒为阳性。每张切片计数200个细胞以上，每个标本观察4张切片，取平均值，细胞凋亡指数=凋亡细胞数/计数细胞总数×100%，凋亡试剂盒由德国Bochringer mannheim公司生产。
1.3增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组化染色
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用PCNA单克隆抗体进行免疫LSAB组化染色。抗体和LSAB试剂盒购自美国DAK0公司。操作按说明书进行，同时设立阳性及阴性对照。阳性结果为细胞核呈棕黄色颗粒状。
1.4bcl-2/bax表达检测
应用bc1-2单抗，bax多抗(DAK0公司产品)，微波抗原修复，免疫组织化学LASB染色，DAB显色。光镜下从染色强度和阳性细胞比例两方面评价染色结果并计分。染色强度分为阴性(-)，弱阳性(+)，阳性(++)和强阳性(+++)。
1.5统计方法
计数资料采用卡方检验，计量资料采用t检验。
2结果
2.1HP感染与慢性胃炎胃粘膜上皮细胞凋亡和增殖关系(见表l)
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表lHP感染与胃粘膜上皮细胞凋亡和增殖关系 组别
n
凋亡指数(%,
±S)PCNA指数
HP阴性
20
4.12±1.14
10.21±4.34
HP阳性
23
17.18±7.02*
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21.60±9.05*
*与HP阴性组比较P<0.01
2.2bc1-2在HP相关性慢性胃炎中的表达
23例HP阳性慢性胃炎中bcl-2表达阳性5例，阳性率为17.4%%，反应强度为(+)。20例HP阴性慢性胃炎中bc1-2表达阳性4例，阳性率20%，反应强度为(+)。HP阳性与HP阴性慢性胃炎中bc1-2表达率差异不明显(P>0.05)。
2.3bax在HP相关性慢性胃炎中的表达
23例HP阳性慢性胃炎中17例bax阳性表达，阳性率为73.9%。反应强度为(++)～(+++)。20例HP阴性慢性胃炎中5例bax表达阳性，阳性率为20%，反应强度为(+)～(++)。HP阳性与HP阴性慢性胃炎比较，bax表达率及表达强度差异显著(P<0.01)。
2.4HP阳性慢性胃炎中bc1-2及bax表达与细胞凋亡的关系(见表2)
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表2HP阳性慢性胃炎中，胃粘膜bcl-2/bax表达与细胞凋亡的关系 组别
n
凋亡指数
bcl-2+
5
7.47±4.40*
bc1-2-
18
19.26±6.04
bax+
17
18.59±7.72*
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bax-
6
9.98±5.40
*:阳性与阴性比较,P<0.01
3讨论
细胞凋亡是细胞死亡的一种方式，它是在某些生理或病理条件下，细胞受到某种信号的触发后主动参与并遵循一定程序的死亡过程。正常情况下，细胞凋亡与细胞增殖一起维持着组织中细胞总数的动态平衡[3]。当细胞凋亡和/或增殖发生异常，则可能导致疾病特别是肿瘤的发生。
本研究采用TUNEL技术和PCNA免疫组化染色方法检测HP相关性胃炎胃粘膜组织细胞凋亡和增殖的改变。结果显示，HP感染患者的胃粘膜中，细胞凋亡指数和增殖指数均显著高于无HP感染者(P<0.01)。其原因有作者认为是HP感染首先引起细胞凋亡继而诱发细胞增殖增加[3]。原位观察HP阴性者胃粘膜组织切片，发现仅少量凋亡细胞和增殖细胞散在分布于粘膜表层，而在HP阳性者胃粘膜中，见凋亡细胞和增殖细胞分布于粘膜全层，并深入腺体的底部和固有膜中。此现象表明HP相关性胃炎胃粘膜组织中存在细胞凋亡和增殖的紊乱，这与其他作者报道相一致[4]。尤应注意的是胃粘膜腺体颈部为上皮细胞生发中心。我们发现该部位存在组织细胞凋亡增加，倘若凋亡过度，则必然导致腺体的丢失和萎缩性胃炎发生[4]。这为HP感染在萎缩性胃炎和胃癌发病中的作用提供了依据。
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bc1-2为重要的凋亡抑制基因，bax是bc1-2家族成员之一，与bc1-2作用相反，能促进细胞凋亡。01tvai[5]和Wyllre等[6]研究发现bc1-2/bax比例关系影响细胞凋亡状态。本研究检测了同一蜡块组织切片的bcl-2和bax基因蛋白表达水平，结果表明，在HP相关性慢性胃炎中，bcl-2表达无明显增强，而bax表达则明显高于HP阴性组(P<0.01)。bc1-2表达阳性组，组织细胞凋亡率显著低于bc1-2表达阴性组(P<0.01)。bax表达阳性组细胞凋亡率则明显高于bax阴性组(P<0.01)。结果说明bc1-2/bax蛋白表达参与调节HP感染引起胃粘膜组织细胞凋亡的分子机制，其中主要与活化bax基因介导细胞凋亡有关。
总之，本研究结果表明HP感染可诱导胃粘膜上皮细胞凋亡及刺激胃粘膜细胞过度增殖，凋亡调控基因bc1-2低表达和/或bax高表达可能参与此调节过程。鉴于HP感染的长期持续性，因此，深入研究HP感染引起胃上皮细胞动力学凋亡增殖改变，将有助于清楚认识HP的致癌机制。
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*通讯作者：Tel：86-20-83827812
Fax：86-20-83827712
参考文献：
[1]胡伏莲.重视幽门螺杆菌与胃肠道疾病关系的研究[J].中华医学杂志，1998，78(7)：483.
[2]Chen G, Sordillo EM,Ramey WG,et al.Apoptosis in gastric epithelial cells is induced by Helicobacter pylori and accompanied by increased expression of BAK[J]. Biochem Biophys Res Commun,1997,239： 626～ 632.
[3]Jones NL, Shannon PT, Cutz E, et al. Increase in proliferation and apoptosis of gastric epithelial cells early in the natural history of Helicobacter pylori infection[J]. Am J Pathol, 1997,151： 1695～ 1703.
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[4]Correa P, Miller MJ. Carcinogenesis,apoptosis and cell proliferation[J]. Br Med Bull, 1998,54(1)： 151～ 162.
[5]O1tvai ZN,Milliman CL, Korsmeyer SJ. Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog, Bax, that accelerates programmed cell death[J]. Cell,1993,74： 609～ 619.
[6] Wyllie AH. Apoptosis. Death gets a brake[J]. Nature,1994,369： 272～ 273.
收稿日期：1999-01-18
修回日期：1999-03-12, 百拇医药